miR-126靶向PIK3R2调控内皮祖细胞及在静脉血栓再通中的作用研究

【摘要】目的:研究miR-126调控内皮祖细胞及对静脉血栓溶解、机化和再通的影响，为慢性深静脉血栓的治疗提供一种新的治疗思路。方法：首先分离、培养及鉴定骨髓源性内皮祖细胞，将miR-126模拟物、抑制剂或阴性对照物用电转的方法转染到内皮祖细胞中，采用MTT、流式细胞术检测miR-126对内皮祖细胞增殖及细胞周期的影响；采用划痕实验、穿膜实验检测miR-126对内皮祖细胞运动迁移能力的影响；采用matrigel管腔形成实验检测miR-126对内皮祖细胞成小管能力的影响。进一步预测miR-126靶基因PIK3R2，并构建包含野生型PIK3R23’UTR和突变体PIK3R23’UTR的Luciferase报告基因载体，检测miR-126对PIK3R2的直接调控作用，Westernblot分析PIK3R2蛋白以及PI3K/AKT信号通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的变化。再构建miR-126慢病毒表达载体（pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126），HEK293T细胞包装、重组、扩增慢病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达，PCR、双酶切、基因测序进行鉴定。pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126体外转染内皮祖细胞，用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测转染后的内皮祖细胞中miR-126的表达。然后结扎大鼠肾下段下腔静脉建立深静脉血栓模型，将慢病毒转染的内皮祖细胞移植到静脉血栓模型中。分为三组：A组(12只)，空白对照组，经尾静脉注射1mlPBS；B组(12只)，EPCs/pLVX-IRES-ZsGreenVector(EPCs/vector)，经尾静脉注入含有1.0×106EPCs/vector的PBS细胞悬液。C组(12只)，EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen-miR-126(EPCs/miR-126)，经尾静脉注入含有1.0×106EPCs/miR-126的PBS细胞悬液。移植后7天、14天取出血栓段下腔静脉及血栓，通过称重评价血栓溶解情况，荧光示踪观察内皮祖细胞归巢到静脉血栓情况，HE染色评价静脉血栓机化及CD34免疫组化观察血栓再通变化。采用SPSS15.0软件进行分析，P<0.05为差异，有统计学意义。结果:成功培养、鉴定了大鼠骨髓源性内皮祖细胞。电转成功后，miR-126对内皮祖细胞早期具有促进增殖及改变细胞周期的作用，后期没有影响。划痕实验及穿膜实验都证实了miR-126模拟物能够显著促进内皮祖细胞的迁移运动能力；miR-126抑制剂则能抑制内皮祖细胞的迁移运动能力。miR-126模拟物可以增强内皮祖细胞的成小管能力，miR-126抑制剂能抑制内皮祖细胞的成小管能力。野生型PIK3R23’UTR和突变体PIK3R23’UTR的Luciferase报告基因载体构建及鉴定成功，共转染miR-126模拟物和pMIR/PIK3R2报告基因载体后，萤光素酶活性明显降低，而共转染miR-126抑制剂和pMIR/PIK3R2报告基因载体后，萤光素酶活性变化不大，共转染miR-126模拟物或抑制剂和pMIR/PIK3R2/mut报告基因载体后则不影响信号强度。上调内皮祖细胞中miR-126表达水平后，其PIK3R2蛋白表达水平明显下降，PI3K和磷酸化的Akt（p-Akt）蛋白表达上调，而下调内皮祖细胞中miR-126表达水平后，其PIK3R2蛋白表达水平明显增加，PI3K和磷酸化的Akt（p-Akt）蛋白表达下调。经酶切及测序结果提示慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126构建正确，能有效转染内皮祖细胞，转染miR-126后在内皮祖细胞的表达较对照组高216倍。内皮祖细胞被移植到静脉血栓后，在7天和14天两个时间段内，EPCs/miR-126组中静脉血栓的重量最低，萤光阳性细胞数目最多，HE染色和CD34免疫组化提示更能促进血栓的机化和再通，均有统计学意义。结论:miR-126能够促进内皮祖细胞成血管能力，包括增殖、迁移和成小管能力，miR-126能够负性调控其靶基因PIK3R2，激活PI3K/AKT信号通路。上调内皮祖细胞的miR-126表达后能够促进静脉血栓溶解、机化和再通。这可能是内皮祖细胞介导的治疗深静脉血栓的一种新思路。
【作者】孟庆友；
【导师】李晓强；
【作者基本信息】苏州大学，胸心血管外科，2014，博士
【关键词】微小RNA-126；内皮祖细胞；调控；慢病毒；血栓再通；

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